材料
A、儀器
1. 凈化工作臺，2.
離心機，3. 恒溫水浴箱，4. 冰箱（4℃）
5. 倒置相差顯微鏡，6. CO2培養箱，7. 振蕩混合儀
8. 酶聯免疫檢測儀，9. 移液槍，10. 電磁力攪拌機，11. 微孔濾器
B、玻璃器皿
1. 吸管，2. 小燒杯（100ml），3. 廢液缸，
C、塑料器皿
1. 吸頭，2. 槍頭，3. 96孔培養板，4. 15ml離心管，
5. 50ml離心管，6. 膠塞，
D、其他物品
1. 微量加樣槍，2. 紅血球計數板，
F、試劑
1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，
4. 雙抗（青霉素、鏈霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDTA
7. 二甲基亞砜（DMSO），
8. MTT溶液：稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml培養液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機上攪拌30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4℃保存備用，兩周內有效。
一、原代細胞培養或細胞株（系）復蘇培養：
（一）細胞原代培養
1.貼壁細胞培養法：
1）、組織塊培養法
將所取得的組織用含青霉素、鏈霉素400U/ml和400ug/ml的生理鹽水漂洗2此，5分鐘/次。取出組織盡可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加兩滴小牛血清，用剪刀盡可能將其剪碎，用吸管將其泥狀的組織點種在培養瓶壁，倒置于37°、5%CO2條件下30分鐘后將培養瓶正置，從培養瓶的一端緩緩加入完全培養液（小牛血清15%、青霉素、鏈霉素各100U、100ug/ml），使組織塊有培養液與其接觸為準，輕輕放置于37°培養。待24小時候補液。
或小塊放置后,輕輕翻轉培養瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內加入適量培養基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37℃溫箱內。 培養2~4小時，待小塊貼附后，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養，動作要輕，嚴禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養失敗，若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養時培養基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養24小時后再補液，培養3~5天時可換液，一方面補充營養，一方面去除代謝產物和漂浮小塊所產生的毒性作用。
其他方法：消化分離法 、器官培養 略
2.懸浮細胞培養法
對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養，或經淋巴細胞分層液分離后接種培養。
（二）細胞株(系)細胞復蘇培養
細胞復蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內使其完全融化。
(3) 然后在無菌下取出細胞。凍存管用75%酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養液。
(4)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養，次日更換一次培養液，繼續培養，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代。或無需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養基貼壁培養12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養基繼續培養。加入的培養液的量依凍存的細胞數量，如果凍存數量為10
6，則稀釋10倍使細胞達到10
5即可。
注意事項
在細胞復蘇操作時，應注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過**易受損的溫度段(-5～0℃)。這樣復蘇的凍存細胞存活率高，生長及形態良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養液，也會獲得較為滿意的結果。
二、細胞維持培養（細胞換液培養）、培養選拔常規觀察
(一)原代細胞的維持
1、貼壁細胞（包括半貼壁細胞的換液）
一般三天后組織塊周圍即可見梭形細胞長出。第三天換液一次，其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養液相同的等量完全培養基。若希望細胞能在較長時間內能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。 待不同組織塊周圍的細胞連接成片時即可傳代。
2、懸浮細胞
凡經培養后只在細胞培養基中懸浮生長而不貼壁的細胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細胞的形態和生長現象，淋巴細胞的短期培養無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細胞不僅會發生轉化而且會發生分裂繁殖，此時培養基中的營養成分并不能維持細胞的營養需求，加之代謝產物增多，pH變酸，細胞不適宜生長，需進行換液。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長期培養時，都需換液培養，待達到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進行換液。
半量換液的方法如下：
將原培養瓶豎起，在30分鐘內，若細胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養基。若細胞不能沉于瓶底，可吸出細胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養基，混勻后再轉入原瓶繼續培養。
（二）傳代細胞維持培養：同上
（三）培養選拔常規觀察：#p#分頁標題#e#
1.培養液
2.細胞生長情況
3.細胞形態變化
4.污染情況
三、細胞的傳代培養：
(1)棄舊培養液：吸除或倒掉原瓶中的舊培養基（以25mL培養瓶為例）。
(2)漂洗：每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS或HANKS液，漂洗貼壁細胞一次后倒掉。 （此步可以省略）
(3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），輕輕搖動培養瓶，經消化液鋪滿所有細胞表面，在倒置顯微鏡下待1/2細胞變園后加適量完全培養液終止。或細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現象時
，倒掉消化液，再繼續作用2～3分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立即終止消化）。在37°或25°以上環境進行消化。
(4)終止：加入完全培養基適量（通常10-20%胎牛血清培養基）5ml，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現泡沫，以避免細胞的機械損傷。
(5)離心：離心（1100rpm）沉淀細胞（5-10分鐘），去除培養基（含胰酶及EDTA）。
(6)計數：離心前先滴好計數板待計數，計算細胞的濃度。
(7)傳代或凍存：離心后用完全培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養（可1:3**1:5傳代，在25cm2的培養瓶中長滿細胞可達5*10
6/ml，經10倍稀釋每瓶達10
5/ml即可，25cm2的培養瓶每瓶5ml培養液）。或用凍存液調整濃度（一般達1*10
7）凍存。（ 到此步時經證實未被細菌或真菌污染，則撤去抗生素，以免對細胞的生長長生不利影響，指原代培養細胞）
四．細胞凍存：
細胞凍存液：
20% 小牛血清
10% 二甲基亞砜DMSO
70% 培養液
操作步驟：
1. 選對數增生期細胞（證明無支原體污染），在凍存前**換液。
2. 按常規方法把培養細胞制成懸液，計數，使細胞密度達5*10
7/ml左右，離心，去上清液。（凍存細胞數量要充分，密度達5*10
7/ml，在溶后稀釋20倍時，仍能保持5*10
5ml數量）。一般25cm
2的培養瓶滿瓶才達到10
5.
3. 加入配置好的凍存液，與去上清液相同的量一滴一滴的加入離心管中，讓侯用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞室培養液中加入保護劑10%二甲亞砜(DMSO)或甘油，可使冰點降低，使細胞內水份在凍結前透出細胞外。（細胞冷凍保存時**常使用的冷凍培養基是含5-10%DMSP和90-95%原來的細胞生長用之新鮮培養基均勻混合。注意由于DMSO稀釋時會釋放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成）
4. 分裝于無菌凍存管中，每管1.5ml懸液。
5. 旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標志。
6. 凍存：
1） 冰箱4℃放2小時，-75℃過夜，轉液氮保存，
2） 4°，0°，-20°各30分鐘（現代分子生物學實驗技術P647），**后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。
附件一、培養細胞的生長狀況觀察
（一）細胞計數操作規程
胎盤藍法原理：（產品批號：T8154，T6146和Z35,962－9）
使用胎盤藍染色決定血細胞總數和活細胞數目，胎盤藍是用于染色的多種染料中能被活細胞排斥的一種染料，這種方法的成立是基于活細胞不能被染色：胎盤藍對血清蛋白比細胞蛋白有一種更強的親和力，如果背景太深，在計數之前細胞應成球狀并重懸在無蛋白的培養基或鹽液中。
方法：
1、預先在平衡鹽液中懸浮細胞（例如：Hank’s平穩鹽液HBSS，產品批號：H2513）
2、取0.5ml 0.4%胎盤藍于一試管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml細胞懸液（稀釋倍數＝5）并且混勻，允許放置5－15分鐘。
注意：如果細胞在胎盤藍中暴露時間過長，活細胞也會像死細胞一樣被染上色。
3、在血細胞計數板上蓋上蓋玻片，使用巴斯德毛細吸管或其它合適的器材取少量的胎盤藍細胞懸液于血細胞計數板上的兩個小室中。將巴斯德毛細吸管小心的靠在蓋玻片邊緣，利用毛細張力充滿小室，不要過度或過少充盈。
1）從血細胞計數板的一個小室開始，計數中間和四角邊長/mm的正方形中的所有細胞數（詳見sigmaP1845的圖樣I）死細胞被染成藍色，分別計數活細胞和死細胞數。
注意：壓線細胞的計數原則，數上不數下，數左不數右（詳見sigmaP1845的圖II）
2）重復上述步驟計數第2個小室
注意：如果超過10%的細胞成串，應重復全部程序通過吹打務必使細胞在原液中和在胎盤藍細胞懸液中一樣分散，如果在10個正方形方格中細胞數少于200個或多于500個（20－50個細胞/正方形）應重復這個步驟，以調節細胞稀釋倍數。
3）準備第二份樣品并重新計數以保證準確
4）細胞計數－血細胞計數板上蓋好蓋玻片的每個正方形（指中央大方格，其長度寬度均為1mm的正方形，與蓋玻片的距離為0.1mm），總體積為0.1mm
3或10
-4cm
3。若1cm
3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的細胞數（和細胞總數）則可以這樣來計算。
每毫升細胞數＝每個正方形的平均細胞數´稀釋倍數´10
4（10個正方形的細胞計數）#p#分頁標題#e#
例：如果每個正方形的平均細胞數是45´5´10
4＝2.25´10
6個細胞/ml
總細胞數＝每毫升細胞數´**初的細胞樣品的體積
例：2.25´10
6 (個細胞/ml) ´10ml（**初體積）＝2.25´10
7個細胞（總細胞）
5）活細胞比例（%）＝總的活細胞數（沒染上色的）¸總的細胞（染上色的和沒染上色的）´100
例：如果每個正方形中沒染上色的（活的）細胞平均數是37.5，總活細胞數＝(37.5´5´10
4)活細胞數/ml´10ml（**初體積）＝1.875´10
7個活細胞，活細胞比率（%）＝1.875´10
7（活細胞數）¸2.25´10
7(總細胞數) ´100＝83%.
血球計數板的使用
16×25型的計數板 將計數室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（100個小方格）計數（見圖二）。將每一中格放大，可見25個小格。計數重復3次，取其平均值。計數完畢后，依下列公式計算：
酵母細胞個數／1mL=100個小方格細胞總數/ 100 ×400×10000×稀釋倍數或：4個中格的細胞數/4×16×10000×稀釋倍數
有一種計數板的結構為25×16，計算如下：4個中格的細胞數/4×25×10000×稀釋倍數
（二）.細胞生長曲線（細胞貼壁率、細胞分裂率：略）
概念：
細胞生長曲線是測定細胞**生長數的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養細胞生物學特性的基本參數之一。一般細胞傳代之后，經過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數目的動態變化，典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數生長期，呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。以存活細胞數(萬／mL)對培養時間(h或d)作圖，即得生長曲線。
方法：
計數法：
1．取生長良好接近匯合的細胞，用胰酶消化，用新培養基制成細胞懸液后計數(見四、細胞傳代培養的實驗步驟)。如是非粘壁細胞，則離心棄舊培養基后，換上一定量的新鮮培養基然后制成細胞懸液計數。
2．根據細胞計數結果按每個小方瓶5×104／mL作傳代培養接種細胞，共接種21瓶細胞。
3．24 h后開始計數細胞，以后每隔24 h計數一次，每次取3瓶細胞，分別進行計數。計算平均值。連續計數7 d。
4．根據細胞計數結果，以單位細胞數(細胞數／mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。
MTT法：
1．制備1 mL細胞懸液。空白對照以1 mL培養基代替細胞懸液。加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT還原為藍紫色甲月贊結晶。
2．加1 mL DTW脫色液，37℃**少靜置30 min(甚**過液)，使甲質顆粒充分溶解。
3．吸取200 μL該溶解液**96孔板孔中，在酶標儀上讀取OD值，檢測波長570 nm，參考波長630 nm。
4．每隔24 h測量一個點，每個點為3個平行樣品的平均值。
CCK-8法：略
CCK-8法的優點： 1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑； 2、CCK-8法能快速檢測； 3、CK-8法的檢測靈敏度很高，甚**可以測定較低細胞密度； 4、CCK-8法的重復性優于MTT法； 5、CCK-8法對細胞毒性小； 6、CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。
CCK-8法的缺點: 1、與MTT法相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。 2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多加。
（三）.活選細胞觀察：相差倒置顯微鏡使用：略
附件二：
細胞裂解液：提取RNA用
0.5% SDS
0.1mmol/L EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
20 ug/ml RNase
TE:RNA、DNA溶解用
1mmol/L EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
附件三.IC50半抑制率實驗：
MTT法：
MTT原理、步驟、結果分析方法及注意事項：MTT全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。
MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。
MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器**好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞**數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度**好在0-0.7 范圍內。#p#分頁標題#e#
MTT一般**好現用現配，過濾后4ºC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，**好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就**不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心,有條件**好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
調pH 7.4
定容1L
MTT法實驗步驟
貼壁細胞：
1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度**1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
2.、5%CO2，37℃孵育，**細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前**下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況
3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。
5、終止培養，小心吸去孔內培養液。
6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置
搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）
懸浮細胞：
1、收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找**佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置
搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
5、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。
注意事項：
（1）選擇適當得細胞接種濃度。
（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。
（3）設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，**后比色以空白調零。
（4）MTT實驗吸光度**后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，
IC50是半抑制率：
一定濃度的某種藥物誘導腫瘤細胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度. IC50值可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，即誘導能力越強，該數值越低,當然也可以反向說明某種細胞對藥物的耐受程度。意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！
舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，**大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計算公式：Pm=0.95，Pn=0.06，P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1，lgI=lg0.1/0.01=1，lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
有一個公式可供參考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg **大劑量
I:lg(**大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應率之和
Pm:**大陽性反應率
Pn:**小陽性反應率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
公式中的**大**小陽性反應率就是**大**小抑制率
例：
用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養基,多少MTT和DMSO合適?根據書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定
一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色
搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。
一般要低于IC50，避免非調亡性殺傷的細胞太多，造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細胞周期的亞G0峰比較明顯。
